Preparo de Meios de Cultura

Preparo de Meios de Cultura
FARMACIA
Os meios de cultura fornecem o conjunto de nutrientes na quantidade adequada para a manutenção dos micro-organismos simulando o ambiente original. Os micro-organismos são capazes de se desenvolverem em muitos lugares diferentes, porém cada um deles têm algumas particularidades quanto às necessidades nutricionais e condições físicas para seu melhor desempenho, por isso existem diferentes tipos de meios de cultura, que são produzidos de acordo com a necessidade dos micro-organismos que se quer cultivar. Podemos classificar os meios de cultura de acordo com vários aspectos, veremos a seguir suas classificações recorrentes.

Classificação quanto ao estado físico
Os meios de cultura podem ser classificados de acordo com seu estado físico em: sólidos, líquidos ou semissólidos. Os meios sólidos possuem um agente solidificante, em geral ágar, em uma concentração de 1 a 2 %. Os meios semissólidos são mais gelatinosos, em uma consistência intermediária com a presença de menos de 1% de agente solidificante. Essa menor consistência permite uma maior motilidade do micro-organismo em cultivo. Os meios líquidos não possuem agentes solidificantes e são frequentemente usados em culturas iniciais, para transferência para outros meios (repiques) e em provas bioquímicas.

Classificação quanto a constituição
Podem ser naturais ou sintéticos. Quando naturais são compostos por extratos vegetais ricos nutricionalmente como extrato de tomate e tubérculos ou extratos de origem animal como caldo de carne, de fígado, cérebro, entre outros. No caso dos meios de origem sintética a composição química de cada elemento constituinte é conhecida e são selecionadas criteriosamente de acordo com o micro-organismo alvo, em geral utilizado para diagnósticos e pesquisa.

Também quando a composição pode ser classificada como básicos ou especiais. Os meios básicos contêm os nutrientes essenciais e permitem o crescimento de uma grande variedade de micro-organismos. Já os meios especiais são preparados de acordo com a necessidade de alguma espécie em particular, em geral possui a mesma constituição de um meio básico com acréscimo de algum nutriente ou composto. Por exemplo, ágar sangue, trata-se de um meio de ágar simples com adição de solução sanguínea ou meio Loeffler, que possui apenas soro bovino em acréscimo.

Classificação quanto a finalidade

Outra classificação existente é de acordo com o tipo de cultivo pretendido. Abaixo estão descritos as principais categorias de meios usadas:

Meios de Transporte e Conservação
: são usadas no início de um cultivo. Por exemplo, se queremos cultivar uma bactéria que está em um alimento ou superfície é o primeiro meio que usamos para dar condições da bactéria tornar-se viável caso o ambiente que ela se encontrava originalmente fosse desfavorável.

Exemplo: Meio Cary Blair, é um meio formulado com pouco nitrogênio para impedir a multiplicação de micro-organismo sendo suficiente apenas para a manutenção dos já presentes. Muito usado para o transporte de material fecal para análise microbiológica.

Meios de Enriquecimento: são meios com nutrientes para os micro-organismos mais difíceis de cultivar. São em geral específicos para o organismo alvo e alguns possuem agentes inibidores de outros micro-organismos que poderiam atrapalhar o cultivo.

Exemplo: O Caldo Tetrationato, possui sais de bile que atuam como inibidores de micro-organismos Gram-positivos e solução de iodo, que inibe micro-organismos da flora intestinal normal.

O tetrationato é usado para cultivo de Salmonella sp.

Meios Diferenciais e Seletivos: esses meios são usados para cultivo diferencial entre micro-organismos com características similares, favorecendo o crescimento de apenas um deles, em geral com agentes inibidores de um dos grupos.

Exemplo: Ágar Citrato Simmons, que verifica a capacidade de utilização do citrato de sódio como única fonte de carbono em um meio alcalino, usado para diferenciação de gêneros e espécies de enterobactérias e não fermentadores.

Meios de Triagem: são usados para análise de atividade metabólica, estratégia que permite a identificação de alguns grupos de micro-organismos.

Exemplo: Meio enterococo, usado para a triagem de micro-organismos resistentes a determinados antibióticos.

Meio de Identificação: parecidos com o de triagem, porém usados em provas bioquímicas e usados para uma identificação de um grupo mais restrito de micro-organismos.

Exemplo: Caldo Sim apresenta em sua formulação o triptofano que é um aminoácido que pode ser transformado por certas bactérias em indol, após adição de outros reagentes. Usado para identificação de algumas enterobactérias.

Procedimentos gerais para preparo de meio de cultura
Hoje o mais comum é a utilização de meios comerciais prontos e/ou semiprontos. A preparação desses meios é bastante simples consistindo basicamente em dissolvê-lo como uma gelatina e distribuir nos tubos ou placas de petri que serão usados. Porém, alguns cuidados gerais devem ser usados para o preparo e validação dos meios de cultura.

Preparação e distribuição
A seguir segue uma descrição simplificada do procedimento de preparo de um meio de cultura geral.

1. Pesar o ágar (pó) e colocar em um béquer ou erlenmeyer com capacidade maior do que o volume que será usado – por exemplo, se for preparar um meio de 100 ml usar um erlenmeyer de 250 ml.

2. Medir o volume de água destilada necessário em uma proveta. A adição da água no meio deve ser realizada colocando-se primeiro uma pequena quantidade de água até que o meio fique úmido e depois acrescentar o restante devagar.

3. Homogeneizar o meio agitando o frasco devagar, com movimentos circulares.

4. Aquecer o frasco em micro-ondas ou em bico de bunsen, sobre uma tela de amianto. Como é preciso agitar constantemente é recomendado uso de luvas térmicas. No caso de uso do micro-ondas deve-se parar pelo menos na metade do tempo para homogeneizar o frasco.

5. O meio não deve chegar à fervura. Deve apenas ser aquecido até se fundir completamente.

6. Os meios para diagnóstico microbiológico passam por algum processo de esterilização antes do uso. Pode ser em autoclave, por 15 minutos a 121ºC, ou por filtração, com filtro de porosidade de 0,22 micra.

7. A distribuição dos meios em tubos ou placas pode ser feita antes ou depois da esterilização. Se for feita antes, as placas podem ser não estéreis, se for depois é preciso usar placas já esterilizadas.

8. Se for feita a autoclavação do meio, tanto distribuído em placas, tubos ou em maior quantidade, deve ser feita com o recipiente semiaberto para a esterilização completa e por igual.

Controle de qualidade
Para a validação de um lote de meio de cultura preparado é preciso retirar uma parcela de tubos ou placas prontas, em geral 10% do lote, e submetê-los a uma incubação a 35ºC durante 24 horas. Depois deste período não deve haver nenhuma alteração do meio: nem de cor ou presença de colônias. Se houver alguma modificação no meio o lote deverá ser esterilizado novamente e se persistir a contaminação, deverá ser descartado. Outro controle de qualidade que deve ser realizado é o Controle de Crescimento. Para esse controle são utilizadas cepas de referência ou com origem definida e viabilidade comprovada. A cepa deve ser inoculada no meio e após o período de incubação, específico para a cepa usada, a leitura deve ser obrigatoriamente positiva.

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