Sequenciamento de DNA

Sequenciamento de DNA
BIOLOGIA
O sequenciamento de DNA é um processo que determina a ordem dos nucleotídeos em uma amostra. Existem vários métodos disponíveis, e cada um apresenta vantagens e desvantagens. Um dos mais utilizado é o chamado método de Sanger também conhecido como de terminação de cadeia com didesoxirribonucleosídeo trifosfato, ele constitui a base da metodologia empregada no sequenciamento do genoma humano.

Sua estratégia consiste em identificar, continuamente e sequencialmente durante o processo, o último nucleotídeo incorporado na extremidade de alongamento da cadeia. Os produtos da reação deverão também portar uma “marca” que permita detecta-los na etapa de análise. O processo é realizado a partir de uma cadeia simples (não dupla) do DNA a ser sequenciado, esta servirá de molde para gerar a outra metade complementar da dupla hélice. Isto é obtido pela desnaturação da “molécula nativa”.

A reação de síntese se processa em condições iônicas e de pH apropriadas, na presença da enzima DNA polimerase e de uma mistura dos 4 nucleotídeos sob a forma de dNTPs (3’-desoxinucleotídeos trifosfatos): dATP, dCTP, dGTP e dTTP sendo um deles marcado radioativamente com ³²P ou 35S; um dos mais utilizado é o dATP ³²P.

Como a enzima utilizada catalisa somente o alongamento da cadeia nascente é necessário também, a presença na reação, de um pequeno fragmento de DNA sintético (XXX) complementar a uma região conhecida (YYY) na extremidade 3’ do DNA molde; estas características permitirão sua hibridização no local mencionado, e fornecerão um ponto de partida para a replicação do DNA. O fragmento XXX, denominado iniciador ou primer, quando marcado, poderá ser utilizado para rastrear o fragmento de DNA recém-sintetizado no lugar do dNTP.

O processo é executado em quatro reações separadas; cada uma delas, contendo adicionalmente pequena quantidade de um, e apenas de um, dos 4 tipos de cada dNTP sob a forma análoga de ddNTPs (2’, 3’-didesoxinucleotídeo trifosfatos).

As formas análogas (ddNTPs) são conhecidas como terminadores, e ao serem incorporados à cadeia nascente bloqueiam todo processo, por não apresentarem 3’OH que permita formar ligação com o próximo dNTP a ser adicionado. Com todos os nucleotídeos normais (dNTPs) presentes, o alongamento da cadeia prosseguirá até que a enzima DNA-polimerase insira um análogo (ddNTP).


Consequentemente e imediatamente, a reação de síntese irá parar no ponto em que seu alongamento foi interrompido: na extremidade e, a molécula estará marcada com ³²P. Os fragmentos assim obtidos, cada qual contendo um resíduo final conhecido, pois se sabe em que tubo de reação o análogo foi adicionado, são separados por tamanho em gel de poliacrilamida individualmente, ou seja, um canal de análise para cada reação. Então, o gel é transferido para um suporte de nitrocelulose (filtro).

Após autorradiografia a ordem dos nucleotídeos, na cadeia de DNA recém sintetizada, pode ser visualizada e obtida diretamente; esta é complementar à da molécula sequenciada que serviu de molde. Portanto, é possível conhecer a sequência de nucleotídeos do DNA sequenciado de 3’ para 5’ partindo-se da parte inferior para a superior do gel.

O método pode ser automatizado utilizando o sequenciador automático, gerenciado por computadores com programas que lêem sequencialmente e identificam os produtos. A automatização permite executar o processo em grande escala, já que, é possível utilizar os 4 didesoxinucleotídeos terminadores (ddNTPs) simultaneamente, através da marcação por fluorescência.

Em cada reação, ou seja, para cada base (A,T,G,C) utiliza-se um fluorocromo diferente (uma cor diferente), de modo que os produtos podem ser reunidos e a eletroforese destes realizada em um único canal do gel de sequenciamento. O sinal fluorescente diferencial emitido por cada fragmento, após iluminação com um feixe de laser, identificará os produtos baseado na diferença de comprimento de onda.

A luz emitida é detectada por escaneamento do gel e a sequência deduzida por computador. Variáveis mais modernas, mais rápidas e poderosas; incluem a robotização total do processo com a inclusão das etapas de purificação e da reação de síntese da cadeia do DNA.

Existe um outro método de sequenciamento de DNA que teve uma ampla aplicação inicialmente, porém é pouco utilizado atualmente. Este é conhecido como o método da degradação química, desenvolvido em 1977, por Maxam e Gilbert. Essa técnica consiste no tratamento com substâncias químicas que cortam a molécula de DNA em nucleotídeos específicos.
Os tratamentos químicos para modificação das bases e clivagem são feitos de maneira que ocorram em G, C, G+A e T+C. Esses fragmentos gerados são analisados em gel de poliacrilamida.

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