Alongamento da Síntese Protéica em Procariotos

Alongamento da Síntese Protéica em Procariotos
BIOLOGIA
O alongamento da cadeia protéica é dependente de três fatores protéicos: EF-Tu, Ef-Ts e EF-G. O EF-Tu medeia a entrada do RNAt contendo o aminoácido correspondente ao códon que se encontra no sítio A do ribossomo, um processo dependente de energia. Em seguida, há a ação do fator EF-Ts, responsável pela liberação do primeiro fator do ribossomo. Este fator ainda consegue regenerar a energia gasta no processo com o fator EF-Tu.
       
No passo da translocação, a cadeia polipeptídica é transferida ao RNAt carregado com aminoácido e presente no sítio A. O ribossomo então se move sobre o RNAm na direção 5´ - 3´do mesmo. Este passo é mediado pelo fator de elongação EF-G. Assim, há a liberação do RNAt presente no sítio P e que não se encontra mais carregado. Posteriormente, há a transferência do RNAt contendo a cadeia polipeptídica em formação do sítio A para o P.
       
O término da síntese protéica ocorre quando o códon seguinte ao processo de translocação, presente no sítio A, é um códon de parada. Estes códons não são reconhecidos por RNAt, mas sim por fatores protéicos que são designados pelas abreviações RF1, RF2 e RF3. A diferença entre estes fatores se deve ao reconhecimento diferencial dos códons de parada. O RF1 reconhece UAA e UAG; o RF-2, os códons UAA e UGA. O RF-3 auxilia em processos de catálise envolvidos com a terminação da cadeia. O fator de liberação então se liga ao códon no sítio a e o polipeptídeo é então liberado do sítio P. A finalização do processo se dá com a dissociação do ribossomo em suas subunidades maior e menor.

A tradução em eucariotos ocorre de maneira bastante similar à de procariotos. Entretanto, alguns detalhes desta etapa são diferentes, como as diferenças quantitativas e qualitativas dos fatores protéicos. A etapa de maior interesse para o desenvolvimento de procedimentos em biotecnologia é o início da tradução de eucariotos.
       
Inicialmente, a primeira diferença do início da tradução em eucariotos em comparação à de procariotos, além de requererem diferentes e mais diversificados fatores protéicos, se refere ao códon de início. Em eucariotos, a única trinca reconhecida com este propósito é o AUG.

Em relação ao reconhecimento do verdadeiro códon de início presente no RNAm, este frequentemente é o primeiro AUG que se encontra logo após ao CAP 5´. A interação da subunidade menor com a estrutura do CAP metilado presente em todos os RNAm de eucariotos requer um grupo de proteínas genericamente conhecidas como eIF4. Após o reconhecimento do CAP pelo eIF4F, qualquer estrutura secundária na região 5´ é removida por uma atividade de helicase. A subunidade menor realiza então um escaneamento sobre o RNAm, parando assim que encontra o primeiro AUG.

Apesar de o primeiro AUG ser o verdadeiro códon de início, foram identificadas outras estruturas que facilitam seu reconhecimento. Assim como em procariotos, há determinadas seqüências que se localizam na vizinhança do AUG, denominadas seqüências de Kozak. Esta é representada por uma seqüência consenso: RNAm 5´ACCAUGG 3´. Apesar de este consenso ser importante, a eficiência da tradução é afetada pela adenina e pela guanina presentes antes e após o AUG, respectivamente.
       
Após a montagem do complexo ribossomo-RNAm, há a adição da primeira metionina ao códon de início. Contudo, ao códon inicial, há a incorporação de uma metionina sem a modificação por um grupo formil. O processo restante é semelhante ao de procariotos.

Depois de finalizar o processo de tradução, a cadeia polipeptídica ainda passa por outros processos de transformação. Assim, para obter uma proteína nativa, a cadeia polipeptídica obtida após a tradução do RNAm é submetida a uma outra etapa, o processamento protéico.
       
Após a síntese da proteína, esta ainda pode sofrer várias transformações. Este processamento é extremamente importante sob o ponto de vista biotecnológico, pois a partir deste passo final há a geração de proteínas funcionais.

Vários são os tipos de processamento que a proteína pode sofrer o que também dependerá do tipo celular em que a macromolécula está sendo expressa. Um exemplo de grande aplicação na biotecnologia é o endereçamento protéico. Este processo pode ocorrer tanto em procariotos como em eucariotos.

Para isso, algumas cadeias protéicas apresentam em sua porção N-terminal uma seqüência de 15 a 25 aminoácidos. Esta estrutura é denominada peptídeo sinal. Seu reconhecimento por fatores e receptores protéicos medeia o transporte e o acoplamento à membrana celular. Para que a proteína seja secretada, o peptídeo sinal é reconhecido pela maquinaria celular, mais especificamente uma peptidase. Esta enzima cliva a cadeia polipeptídica, separando a proteína de seu peptídeo sinal e permitindo que a proteína seja finalmente liberada da célula.

Aliado ao peptídeo sinal, a proteína pode conter na sua porção C-terminal uma seqüência conhecida como sinal de ancoramento.  Assim, o peptídeo sinal endereça a proteína até a membrana celular. O sinal de ancoramento, ao contrário do peptídeo sinal, não será clivado. Por possuir características hidrofóbicas compatíveis com a da membrana celular, permite que a proteína permaneça ancorada à membrana.

               
        Outros tipos de processamento extremamente importantes para obter proteínas funcionais são processamentos que certas proteínas sofrem quando são expressas em células eucariotas. Exemplos são seqüências que sinalizam a glicosilação. Além da importância deste processo para gerar proteínas funcionais, este requerimento é uma das preocupações da indústria farmacêutica. A glicosilação é essencial para a geração de uma resposta imunológica eficaz, por exemplo.

As células não expressam todas as proteínas por períodos de tempo indeterminados. O gasto de energia é demasiadamente alto, prejudicando a homeostase celular. Por isso, as células desenvolveram mecanismos que permitem que a célula reconheça o momento em que genes relacionados a uma determinada função sejam expressos.

A obtenção de determinados produtos gênicos é essencial para a biotecnologia. Apesar de se ter o conhecimento de que a informação genética que determina estes produtos ser representada por uma seqüência de nucleotídeos e que a combinação destes é traduzida em uma proteína, outro esclarecimento é necessário: como ocorre o controle da síntese protéica?

O controle da expressão gênica é um passo fundamental para a manutenção da homeostase celular. Um exemplo pode ser observado em bactérias quanto à expressão de determinados genes envolvidos com o metabolismo de açúcares.  Os açúcares constituem uma fonte de carbono essencial para a produção de energia. Diversos tipos podem ser utilizados com este propósito, como lactose, glicose, maltose, galactose e xilose.

O metabolismo de cada açúcar é dependente da produção de diferentes enzimas. Se a célula sintetizar todas as enzimas, mesmo que não haja necessidade, isto representa um gasto energético desnecessário e inviável para o organismo. Portanto, o controle estrito da síntese de enzimas é um dos passos chaves para a viabilidade celular e manutenção de culturas responsável pela síntese de produtos biotecnológicos.

 A regulação da expressão gênica pode ser obtida pelo controle tanto da transcrição como de processos subseqüentes. Entretanto, normalmente este controle é feito a nível transcricional, para que a célula evite gastos energéticos e de precursores. Dois passos chaves são fundamentais para a inibição da síntese de proteínas desnecessárias em determinado momento:

 As células precisam ser capazes de inibir a transcrição de um determinado gene ou de um grupo deles;

 As células precisam reconhecer determinadas condições ambientais na qual ela deva ativar ou reprimir a transcrição de genes.

 O modelo clássico que esclareceu muitos dados a este respeito foi obtido com estudos sobre o metabolismo da lactose em E. coli, em 1950. François Jacob e Jacques Monod estudavam os mecanismos envolvidos com o metabolismo da lactose. Os pesquisadores compararam os níveis de expressão protéica sob condições fisiológicas e após a adição de lactose. Após a adição desta molécula, observou-se que havia um aumento de cerca de 1.000 vezes da expressão de algumas proteínas além do que se observava sob condições fisiológicas. Assim, substâncias que agem como a lactose foram genericamente denominadas indutores.

 Jacob e Monod seguiram com outros experimentos. O objetivo destes cientistas era o de responder como a bactéria é capaz de reconhecer especificamente quando deve haver a expressão de uma determinada proteína e qual seria o papel dos indutores neste processo. Para que a bactéria consiga se adaptar frente a esta mudança no suplemento de lactose, duas enzimas são requeridas: uma permease, responsável pelo transporte da lactose para dentro da célula, e a beta galactosidase, uma enzima que cliva a molécula de lactose em galactose e glicose. Estas duas enzimas são codificadas por dois genes distintos e contínuos, o lacZ e o lacY, respectivamente. Neste metabolismo, um terceiro gene, o lacA, também está envolvido. Este último codifica uma transacetilase; entretanto, sua função específica ainda não está bem elucidada.

Uma hipótese que os pesquisadores levantaram com o intuito de explicar como agem os indutores seria de que estas moléculas ativavam um intermediário da beta galactosidase que estava previamente acumulada. Contudo, estudos posteriores demonstraram que após a adição do indutor, havia a síntese de novas moléculas. Assim, se tornou claro que a célula dispõe de mecanismos capazes de ativar a expressão gênica.

Quando Jacob e Monod induziram o aumento da expressão da galactosidase, eles também induziram a expressão da permease e da transacetilase. Foram realizadas então análises de mutantes que confirmaram que estas proteínas são codificadas por genes diferentes. Portanto, os pesquisadores identificaram três genes distintos, cuja transcrição é controlada de forma coordenada. Estudos posteriores de mapeamento demonstraram que os genes estavam proximamente ligados no cromossomo e que estes eram transcritos em um mesmo RNAm. A transcrição deste RNAm policistrônico demonstrou, portanto, que a regulação da transcrição é um processo coordenado.

A análise de mutantes permitiu ainda que muitos clones de fenótipos diferentes fossem analisados. Inicialmente, os pesquisadores isolaram um clone cujas células expressavam as três enzimas envolvidas no metabolismo da lactose a um nível máximo. O mais intrigante era que isto ocorria tanto na presença ou mesmo na ausência de um indutor.


 Assim, isolou-se um mutante defectivo não na atividade enzimática, mas sim no controle da produção enzimática. A expressão gênica deste mutante foi definida como constitutiva. A mutação ocorreu em uma região próxima à região onde os genes destas proteínas se encontravam; contudo, a alteração não ocorria na seqüência codificadora destes genes. Assim, foi descoberto outro gene envolvido na regulação da transcrição, o gene lacI. 

A seqüência codificadora relativa ao gene lacI foi localizada no mapa genético a uma certa distância dos outros genes envolvidos com o metabolismo da lactose. Se mutantes defectivos nesta enzima apresentavam como fenótipo uma expressão constitutiva, supôs-se que a proteína LacI tinha uma função reguladora. No caso, ela atuava inibindo a transcrição de genes do operon Lac.

Uma propriedade essencial da molécula repressora é o reconhecimento de uma determinada seqüência de DNA para assegurar sua ligação somente em sítios envolvidos com o controle da expressão de genes específicos. Assim, evita-se que a ligação aleatória a outras regiões do DNA cromossomal prejudiquem a expressão de outros genes. Como a expressão dos genes estruturais do operon Lac é bloqueada na ausência do indutor, se diz que o operon está sob controle negativo do repressor LacI.

 A molécula repressora contém dois sítios de reconhecimento: um sítio que reconhece uma seqüência de DNA e outro que reconhecem a lactose e seus análogos. Quando a lactose se liga ao repressor, este sofre mudanças alostéricas, o que faz com que a proteína perca afinidade ao DNA. Assim, o sistema é provido de um dos requerimentos básicos, o de reconhecer determinadas condições nas quais deve haver a indução da expressão gênica. Por este motivo, moléculas como a lactose e seus derivados são denominados indutores.

O inibidor se liga a uma seqüência de DNA conhecida como operador, que se localiza próximo ao conjunto de genes que ele controla. No caso, o repressor do operon lactose, o operador se liga a uma região do DNA próxima ao gene lacZ. A ligação do repressor ao operador inibe o início da transcrição pela RNA polimerase.

 Clones com mutações no operador também foram isolados, o que permitiu esclarecer melhor o papel desta seqüência na regulação do operon Lac. A expressão dos genes nestes mutantes era constitutiva, mesmo na presença de uma molécula repressora ativa. Assim, outra terminologia em relação à dominância destas mutações na expressão gênica foi adotada. A habilidade de um gene afetar a expressão de outros próximos a ele no mesmo cromossomo é denominada dominância cis. Portanto, este novo conceito se refere à interação física de proteínas difundíveis com contato direto a uma seqüência de DNA; no caso, esta é representada pelo operador. Esta definição também permitiu que outra terminologia fosse adotada. A regulação por produtos difusíveis, como a proteína inibidora LacI é conhecida como dominância trans.

Análises de mutantes ainda revelaram a importância de regiões promotoras. No operon Lac, elas se localizam entre o operador e o gene lacI. Mutações nesta seqüência também são cis dominantes, o que já é esperado para a seqüência reconhecida pela RNAP e responsável pelo o início da transcrição. Um esquema geral da regulação do operon Lac.

Estudos adicionais com o operon Lac demonstram que para a expressão de genes envolvidos com o metabolismo da lactose não bastava apenas a adição do indutor. Quando havia suplemento de glicose à célula, mesmo na presença da lactose, não induzia a expressão gênica relativa ao operon Lac.  Isto se deve ao fato de que a maquinaria celular utiliza preferencialmente o metabolismo de glicose quando esta está presente. Assim, a célula inibe a expressão dos genes do operon Lac quando a glicose está presente, demonstrando outro controle adicional ao operon.

 O metabolismo de glicose inibe a expressão do opero Lac e este controle é denominado repressão catabólica, o qual é exercido por um produto derivado do catabolismo da glicose, o monofosfato adenosina cílico (cAMP). Quando a glicose está presente em altas concentrações, os níveis de cAMP são baixos; por outro lado, quando os níveis de glicose são baixos, os níveis de cAMP são altos. 

Apesar de altos níveis de cAMP serem necessários para a ativação do operon Lac, uma outra proteína é necessária para iniciar o processo. A proteína CAP, codificada pelo gene crp, forma um complexo com cAMP, que será então capaz de se ligar ao operon. A proteína ligada ao DNA interage com a RNAP, aumentando a afinidade desta ao promotor. Portanto, além do controle negativo exercido pela proteína LacI, o operon ainda está submetido a um controle positivo. Neste caso, o ativador cAPM-CAP é requerido para iniciar a expressão gênica.

Para que os ativadores e repressoras sejam capazes de exercer de maneira eficaz suas atividades, estas moléculas precisam apresentar duas conformações: uma em que sejam capazes de se ligar ao DNA e outra em que esta ligação não seja possível. Para isso, os ativadores e repressores apresentam dois sítios de ligação: um ao DNA e outro ao sítio alostérico; este último interage com os efetores. Quando os efetores, que no caso do operon Lac são os próprios indutores, se ligam ao sítio alostérico, eles induzem uma mudança conformacional na proteína reguladora, induzindo uma alteração na estrutura do domínio que se liga ao DNA. 

A ação dos efetores baseadas na sua ligação aos sítios alostéricos varia de acordo com cada situação. Em algumas, o ativador ou repressor precisam se ligar ao seu efetor para conseguir se ligar ao DNA; em outros casos, as proteínas reguladoras se ligam ao DNA somente na ausência de seus efetores. 

       

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