Técnica de Biologia Molecular: PCR (Reação em Cadeia da Polimerase)
Prof. MSc. Ronaldo de Jesus Costa
Considerada uma técnica de biologia molecular revolucionária, a reação em cadeia da polimerase (PCR – Polymerase Chain Reaction) permitiu o rápido desenvolvimento do estudo de sequências de ácidos nucléicos.
Desenvolvida por Kary Banks Mullis, em abril de 1983, essa técnica de biologia molecular consiste em nada mais que a síntese enzimática de cópias de ácidos nucléicos em laboratório. O cientista recebeu o prêmio Nobel de química de 1993 por sua descoberta.
A técnica de biologia molecular por PCR promove, in vitro, por meio de artifícios de variação de temperatura, o que o organismo realiza naturalmente, em condições fisiológicas – a duplicação de cadeias de DNA, envolvendo nucleotídeos, sequências iniciadoras (primers) e enzima polimerases. Assim, é possível a obtenção de muitas cópias de uma sequência específica de ácido nucléico, a partir de uma fita molde.
O princípio da PCR envolve três etapas básicas por ciclo, estimuladas pelo calor, que são repetidas por várias vezes, em ciclos:
- Abertura da fita de DNA que servirá de molde, por desnaturação térmica (etapa com duração entre 30s e 1min a temperatura de 92-96ºC);
- Pareamento de oligonucleotídeos sintéticos, que funcionam como os iniciadores da reação de polimerização, a cada uma das fitas do DNA molde, à região complementar da fita que sofrerá a duplicação (duração de 30s a 1min a temperatura entre 58 e 65ºC);
- Polimerização, através de uma enzima polimerase, das novas fitas de DNA a partir de cada um dos iniciadores, utilizando cada um dos quatro dNTP como substrato da reação de polimerização (duração entre 45s e 1min, a 72ºc).
Cada ciclo é repetido em torno de 60 vezes, e promove a amplificação da região alvo determinada conforme afinidade das sequencias iniciadoras (primers).
Assim, o iniciador reconhece, por complementaridade, o local de início do local a ser amplificado, efetua a ligação e sinaliza para a polimerase o início da sequencia a ser replicada.
O grande problema inicial foi a desnaturação seguida da enzima polimerase, que, obtida de Escherichia coli, não suportava a temperatura para abertura das fitas de ácidos nucléicos. Assim, a cada ciclo, uma nova quantidade de enzima deveria ser adicionada.
Em 1988, contudo, Randall Saiki e colaboradores substituíram a polimerase de E. coli pela já conhecida Taq polimerase, polimerase da bactéria Thermus aquaticus, que vive em águas quentes de gêiseres e vulcões submersos, e possui um ponto de crescimento ótimo entre 70 e 75ºC.
Assim, essa substituição promoveu maior independência ao processo além de aumentar a confiabilidade por redução de riscos de contaminação.
Referências
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